細(xì)胞內(nèi)的聯(lián)合創(chuàng)造：外泌體、線粒體、巨噬細(xì)胞的神秘互動(dòng)
作者：admin2024-10-18 14:02
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1、本研究敢于大膽假設(shè)：受先前研究表明巨噬細(xì)胞在肺纖維化（PF）期間增加線粒體生物發(fā)生和裂變增加的啟發(fā)，假設(shè)線粒體質(zhì)量可能作為PF中肺巨噬細(xì)胞群體分類的新標(biāo)志；2、本研究將巨噬細(xì)胞重新分類，選擇具有高線粒體質(zhì)量發(fā)揮促纖維化功能的亞型，通過敲除Drp1可阻斷M?mitohigh的纖維化作用。此外，將siDrp1 遞送至 M?Mitohigh也可以通過外泌體組合緩解肺纖維化。綜合來看，本文構(gòu)建了一種名為“ExosomeMMP19（ExoMMP19）”的通路外泌體，在其表面顯示基質(zhì)金屬蛋白酶-19（MMP19），以局部破壞纖維化肺中過量的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）。此外，從線粒體與巨噬細(xì)胞相關(guān)性的大熱點(diǎn)入手，創(chuàng)新性地篩選巨噬細(xì)胞并將siRNA裝載Exo靶點(diǎn)，基于Drp1功能搭建機(jī)制，為ExoTx的傳遞鋪平道路。題目：促纖維化巨噬細(xì)胞靶向通過外泌體配方傳遞線粒體保護(hù)劑，以減輕肺纖維化
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肺纖維化（PF）是一種毀滅性的肺部疾病，其特征是肺泡上皮損傷、成纖維細(xì)胞灶積聚、進(jìn)行性ECM和膠原沉積。更糟糕的是，PF的預(yù)后較差，治療選擇有限。作為細(xì)胞動(dòng)力源，線粒體在信號傳導(dǎo)、代謝和細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用，先前的研究表明，線粒體功能障礙正在成為PF發(fā)展的關(guān)鍵病理特征。巨噬細(xì)胞在維持免疫穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)適應(yīng)性炎癥反應(yīng)方面起著關(guān)鍵作用，因此，根據(jù)線粒體質(zhì)量對肺巨噬細(xì)胞群進(jìn)行重新分類可能為巨噬細(xì)胞分類提供一種新的方法，并作為治療PF的有吸引力的治療策略。鑒于原纖維化巨噬細(xì)胞通過啟動(dòng)線粒體裂變對PF發(fā)病機(jī)制的貢獻(xiàn)，靶向Drp1可能是治療PF的一種有吸引力的治療方法。此外，外泌體是目前作為藥物遞送的合理載體出現(xiàn)的，是直徑為40-150 nm的細(xì)胞外囊泡。既往研究已確定外泌體是潛在的吸入藥物載體。本研究首先對pathfinder外泌體ExoMMP19和治療性外泌體ExoTx進(jìn)行了設(shè)計(jì)?；赑TGFRN和生物素-親和素系統(tǒng)，構(gòu)建了一種新型的治療性外泌體ExoTx，通過靶向M?mitohigh中的Drp1來治療PF。此外，鑒于肺纖維化間質(zhì)，MMP19，家族內(nèi)肽酶可以降解ECM在肺中，通過融合蛋白MMP19-PTGFRN-Flag，允許MMP19-PTGFRN-Flag-修飾外泌體（ExoMMP19）破壞生物屏障和ExoTx交付。 1.肺巨噬細(xì)胞群可分為低線粒體質(zhì)量（M?mitolow）巨噬細(xì)胞和高線粒體質(zhì)量（M?mitohigh）巨噬細(xì)胞為了闡明肺巨噬細(xì)胞線粒體質(zhì)量的差異，研究者們測量了野生型C57BL/6小鼠和博萊霉素（BLM）誘導(dǎo)的PF小鼠肺中的線粒體質(zhì)量。值得注意的是，BLM誘導(dǎo)的PF小鼠的巨噬細(xì)胞中的線粒體質(zhì)量增加（圖1B）。接下來，對BLM誘導(dǎo)的小鼠的肺M?mitolow和M?mitohigh群體進(jìn)行分類，并使用qRT-PCR檢測促纖維化細(xì)胞因子的相對mRNA水平（圖1A）。結(jié)果顯示，與M?mitolow相比，M?mitohigh中轉(zhuǎn)化生長因子1（Tgfβ1）、血小板衍生生長因子（Pdgfα）、幾丁質(zhì)酶3樣1（Chi3l1）、腫瘤壞死因子（Tnfα）、白細(xì)胞介素1（IL1β）和細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)因子2（Ccn2）顯著增加。對不同表達(dá)基因（DEGs）的分析顯示，M?mitohigh中有3842個(gè)基因顯著高于M?mitolow（圖1C）?；蚣细患治觯℅SEA）顯示，它們在參與線粒體裂變正調(diào)控的通路中富集，并顯著參與了線粒體質(zhì)量的調(diào)控（圖1D）。此外，這些基因的表達(dá)顯著上調(diào)（圖1E）。為了驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，研究者進(jìn)行了qRT-PCR，驗(yàn)證了Drp1是M?mitohigh中表達(dá)最多的基因（圖1F）。
圖1 Drp1在PF小鼠的M?mitohigh中高表達(dá)2.抑制Drp1可以恢復(fù)線粒體功能障礙，降低體外纖維化基因的表達(dá)為了進(jìn)一步闡明Drp1與線粒體質(zhì)量、線粒體功能和促纖維化基因之間的關(guān)系，用BLM暴露的MLE-12上清液處理BMDM，然后用siDrp1轉(zhuǎn)染48 小時(shí)（圖 2 A）。首先，使用qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法分析Drp1的mRNA和蛋白水平。結(jié)果顯示，siDrp1組的mRNA和蛋白水平顯著低于PBS組和siNC組（圖2B和C）。圖2D 表明，siDrp1 組在用BLM暴露的MLE-12上清液處理的BMDM中具有較低的線粒體質(zhì)量。接下來，評估了Drp1在調(diào)節(jié)BMDM中 mtROS和Δψm中的作用。在本研究中，發(fā)現(xiàn)敲低Drp1下調(diào)mtROS水平，同時(shí)上調(diào)BMDM中的Δψm水平（圖 2E 和 F）。此外，使用透射電子顯微鏡（TEM）評估了線粒體的形態(tài)，還發(fā)現(xiàn)與其他組相比，siDrp1組的BMDM表現(xiàn)出線粒體減少但線粒體長度增加（圖2G和H）。鑒于 Tgfβ1、Pdgfα、Chi3l1、Tnfα、IL1β 和 Ccn2 顯著參與 PF，在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，驗(yàn)證了 Drp1 是否調(diào)控這些纖維化基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照組相比，siDrp1顯著下調(diào)了這些纖維化基因的mRNA水平（圖2 I）。上述結(jié)果表明，Drp1在線粒體功能調(diào)控和促纖維化基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用。
圖2 干擾Drp1逆轉(zhuǎn)線粒體功能障礙，下調(diào)促纖維化基因3.Drp1在CD206+巨噬細(xì)胞中高表達(dá)為了區(qū)分兩個(gè)表型不同的巨噬細(xì)胞群體，通過RNA-Seq分析和qRT-PCR進(jìn)一步確定了M?mitolow和M?mitohigh之間表面基因的差異表達(dá)。圖3A、B顯示，M?mitohigh與M?mitolow相比高表達(dá)的前20個(gè)細(xì)胞表面基因中，CD206、CD86、CD80、CD163、CD200R表達(dá)最高，CD206的基因表達(dá)上調(diào)最顯著。接下來，分析了BLM誘導(dǎo)的小鼠肺CD206+巨噬細(xì)胞與M?mitohigh之間的相關(guān)性（圖3C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，與M1/M2范式不同，CD206+巨噬細(xì)胞可能代表M?mitohigh亞群?？紤]到M?mitohigh中CD206和Drp1表面標(biāo)記物顯著增加，可以確定Drp1在CD206+巨噬細(xì)胞中是否增加（圖3C）。通過對BLM誘導(dǎo)的PF小鼠的肺CD206+巨噬細(xì)胞和CD206-巨噬細(xì)胞進(jìn)行分類，并用qRT-PCR檢測其Drp1 mRNA水平，發(fā)現(xiàn)CD206+巨噬細(xì)胞中Drp1水平高于CD206-巨噬細(xì)胞。Drp1也被發(fā)現(xiàn)過表達(dá)，這可以通過相肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和I型膠原a1（Col1a1）雙陽性纖維化肺組織中CD206+巨噬細(xì)胞的熒光強(qiáng)度增加來證明（圖3E）。
圖3 Drp1在CD206+巨噬細(xì)胞中高表達(dá)4.siDrp1負(fù)載的外靶蛋白（ExoTx）可減輕線粒體功能障礙和抑制纖維化基因的表達(dá)接下來，BLM誘導(dǎo)的小鼠被迫用PBS/ExosiNC/ExoTx進(jìn)行氣管內(nèi)吸入。48 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測BLM誘導(dǎo)小鼠肺CD206+巨噬細(xì)胞的線粒體質(zhì)量。值得注意的是，與PBS組和ExosiNC組相比，ExoTx降低線粒體質(zhì)量更顯著（圖4A）。此外，TEM顯示ExoTx中的肺巨噬細(xì)胞與對照組相比，表現(xiàn)出更少的線粒體和增加的線粒體長度（圖4B和C）。然后，通過流式細(xì)胞術(shù)對BLM誘導(dǎo)小鼠的肺CD206巨噬細(xì)胞進(jìn)行分選，并進(jìn)行qRT-PCR分析（圖4D）。與預(yù)期的一樣，結(jié)果顯示ExoTx顯著下調(diào)了Drp1 mRNA（圖4E）。與siDrp1在體外的作用一致，ExoTx也顯著下調(diào)了CD206+巨噬細(xì)胞中Tgfβ1、Pdgfα、Chi3l1、Tnfα、IL1β和Ccn2的mRNA水平（圖4F）。綜上所述，ExoTx在體外和體內(nèi)治療的結(jié)果表明，抑制巨噬細(xì)胞中的Drp1基本上是抑制纖維化基因的一種可行方法。
圖4 ExoTx在體內(nèi)降低線粒體質(zhì)量，下調(diào)促纖維化基因為了確定ExoMMP19是否能降解ECM，研究者們將PBS/ ExoNone/ExoMMP19添加到小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞中（圖5A）。Western blot結(jié)果顯示，ExoMMP19顯著降低了L929細(xì)胞中纖維連接蛋白、Col1a1和α-SMA的表達(dá)（圖5B）。接下來，為了評估外泌體在體內(nèi)的分布，將DiR標(biāo)記的外泌體吸入肺，使用IVIS測量DiR標(biāo)記的外泌體的分布（圖5C）。值得注意的是，與對照組相比，ExoMMP19具有更強(qiáng)的在肺內(nèi)積累的能力（圖5D）。然后使用免疫熒光追蹤DiI標(biāo)記的外泌體（圖5E），結(jié)果顯示ExoMMP19定位于膠原標(biāo)記的較少纖維化區(qū)域，而對照組的外泌體與纖維化區(qū)域重疊，表明ExoMMP19降解了過度的膠原（圖5F和G）。由于纖維化肺中過多的ECM可以阻止外泌體到達(dá)纖維化區(qū)域，因此在小鼠吸入ExoNone/ExoMMP19后30分鐘，將DiI標(biāo)記的ExoTarget給予BLM小鼠，以評估靶向CD206+巨噬細(xì)胞的效果(圖5H)。如圖5I和J所示，在ExoTarget+ExoMMP19組中，F(xiàn)4/80和CD206雙陽性細(xì)胞中DiI的熒光強(qiáng)度與ExoTarget + ExoNone組相比顯著增強(qiáng)。流式細(xì)胞術(shù)也顯示ExoMMP19提高了ExoTarget靶向CD206+巨噬細(xì)胞的功效(圖5K)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明ExoMMP19可以潛在地作為肺纖維化治療的探路者。
圖5 ExoMMP19降解了過量的ECM，提高了ExoTarget的靶向效果
