前言  細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的基本概念：

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（Wound Healing）是一種操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的研究細(xì)胞遷移/腫瘤侵襲的體外實(shí)驗(yàn)方法。這種方法的原理是，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到融合成單層狀態(tài)時(shí)，在融合的單層細(xì)胞上劃痕工具制造一個(gè)空白區(qū)域，空白區(qū)域的細(xì)胞被機(jī)械力去除掉了，通過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，觀察細(xì)胞向無(wú)細(xì)胞區(qū)域遷移的情況，通過(guò)測(cè)量細(xì)胞的遷移距反映細(xì)胞的遷移能力。

細(xì)胞遷移的重要性

細(xì)胞遷移(cell migration)：也稱為細(xì)胞移動(dòng)、細(xì)胞爬行或細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，是指細(xì)胞在接收到遷移信號(hào)或感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動(dòng)。

　　它參與到很多生理和病理的活動(dòng)中，如下：

　　免疫：如淋巴細(xì)胞的定向遷移是其分化成熟和發(fā)揮功能的關(guān)鍵之一;

　　炎癥：炎癥反應(yīng)重要的功能是將白細(xì)胞送到炎癥灶，白細(xì)胞遷移到炎癥部位并發(fā)揮其吞噬和組織損傷作用;

　　腫瘤轉(zhuǎn)移：腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤惡化后常見的活動(dòng)，如侵入淋巴管、血管后隨脈管系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;

　　損傷修復(fù)：當(dāng)機(jī)體發(fā)生損傷時(shí)，免疫細(xì)胞和血小板會(huì)遷移到損傷部位，參與消炎和凝血;

　　胚胎發(fā)育：胚胎期不同類型祖細(xì)胞遷移至特異靶位以保證各組織、器官的正常發(fā)育。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的基本原理

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是目前測(cè)定細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)與修復(fù)能力的常用也是簡(jiǎn)單的方法，基本原理是：在融合的單層細(xì)胞上人為制造一個(gè)空白區(qū)域，稱為“劃痕/傷口”，邊緣的細(xì)胞會(huì)逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕/傷口”愈合。因其類似體外傷口愈合過(guò)程，又名傷口愈合實(shí)驗(yàn)（Wound-Healing Assay），廣泛用于可以觀察藥物、基因等外源因素對(duì)細(xì)胞遷移和修復(fù)的影響。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)步驟

標(biāo)記六孔板

用marker筆在六孔板底部畫平行線，平行線之間的距離0.5cm，為了保證后續(xù)拍照位置是相同的；

鋪板

細(xì)胞重懸鋪板，密度控制在第二天長(zhǎng)滿，若過(guò)夜后細(xì)胞完全長(zhǎng)滿，也可以適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，但如果細(xì)胞密度已經(jīng)很大，盡量重新鋪板，因?yàn)榭赡苓^(guò)一 天后細(xì)胞太滿，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)逐漸變差，后續(xù)細(xì)胞可能不遷移而是凋亡；

制造劃痕

第二天用直尺比著使用10ul槍頭制造劃痕，劃痕方向與標(biāo)志線垂直，保持力度一致，盡量一次性劃完，然后PBS沖洗3次，洗去漂浮的細(xì)胞

為了減少細(xì)胞增殖所引起的假陽(yáng)性結(jié)果，降低細(xì)胞增殖對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，將完全培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基和低血清培養(yǎng)基（FBS＜2%繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞）；

拍照

拍照前用PBS沖洗3次，一般認(rèn)為24h為細(xì)胞的一個(gè)周期，所以檢測(cè)時(shí)間不要超過(guò)一個(gè)周期的時(shí)間，按照6孔板背后畫線的垂直方向劃痕，

選擇合適時(shí)間點(diǎn)拍照，如0h，6h，12h，24h后取出細(xì)胞于顯微鏡下拍照。

數(shù)據(jù)處理與繪圖

使用image j分析每個(gè)時(shí)間點(diǎn)劃痕的寬度或劃痕的面積。

使用image pro plus 可以測(cè)量劃痕位置的面積和高度，將面積除以高度可以得到平均的劃痕寬度，將0 點(diǎn)的劃痕寬度減去實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的劃痕的寬度，得到的就是細(xì)胞遷移的距離，然后使用距離值按如下公式進(jìn)行計(jì)算migration index。

計(jì)算公式如為：migration index=migration distance of test group/migratance distance of control group

將3 次獨(dú)立重復(fù)的數(shù)據(jù)都分析完后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制柱狀圖。

常見問(wèn)題解答

1. 劃痕實(shí)驗(yàn)為什么一般選擇6孔板？

因?yàn)?孔板大小適中，可保證有相當(dāng)距離的平直劃痕，便于觀察；當(dāng)然若是需要高通量初篩時(shí)，也可以用12或者24孔板。

2. 為什么細(xì)胞的接種密度原則為：過(guò)夜為100%融合？

若過(guò)夜后細(xì)胞未100%融合，雖可以適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，但因細(xì)胞密度已經(jīng)很大，所以細(xì)胞狀態(tài)會(huì)逐漸變差，后續(xù)細(xì)胞可能不遷移而是凋亡。

3. 如何降低細(xì)胞增殖對(duì)遷移造成的假陽(yáng)性結(jié)果？

① 使用無(wú)血清或低血清培養(yǎng)基(<2%)可降低細(xì)胞增殖對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；② 一般認(rèn)為24h為細(xì)胞的一個(gè)周期，在選取合適的時(shí)間點(diǎn)（6，12，24h）檢測(cè)劃痕寬度時(shí)，不要超過(guò)細(xì)胞一個(gè)周期的時(shí)間；③  如果要單純考慮細(xì)胞遷移，可以先用絲裂霉素（1μg/ml）處理1h，抑制細(xì)胞的分裂。

4. 如何確保拍照的觀察點(diǎn)？

按照6孔板背后畫線的垂直方向劃痕，可以形成若干交叉點(diǎn)，劃痕一次與5條定位線相交，就有10個(gè)可固定監(jiān)測(cè)點(diǎn)，以解決了前后觀察時(shí)位置不固定的問(wèn)題。

5. 細(xì)胞不遷移怎么辦？

避開細(xì)胞狀態(tài)的影響，需要考慮細(xì)胞自身的遷移能力，并非所有細(xì)胞都適合劃痕實(shí)驗(yàn)，以乳腺癌為例，乳腺癌細(xì)胞MCF-7幾乎很難遷移，而MDA-MB-231具有很強(qiáng)遷移性。

6. 細(xì)胞劃痕法有哪些不足？

① 適用的細(xì)胞類型范圍小，一是需要遷移強(qiáng)的細(xì)胞，而且對(duì)無(wú)血清的環(huán)境有較強(qiáng)的忍受力（至少24h）然而很多腫瘤細(xì)胞系在無(wú)血清培養(yǎng)下，12h細(xì)胞凋亡就超過(guò)50%，因此細(xì)胞劃痕法對(duì)部分腫瘤細(xì)胞并不適用。② 自身操作的實(shí)驗(yàn)誤差，如劃痕距離不一致等。

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