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產(chǎn)品說明書下載

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡介

TUNEL(TdT mediated  dUTP Nick End Labeling) 技術(shù)可對組織或細(xì)胞中凋亡小體或單個凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色，能準(zhǔn)確反映細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征。凋亡細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活而將自身染色體DNA切斷成產(chǎn)生大量的3-OH 末端片段，利用這一特點，用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Trans-ferase,TdT)  將標(biāo)有標(biāo)記物 (dUTP-生物素)的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移到3-OH 末端，再與HRP標(biāo)記的鏈酶親和素以及DAB顯色液結(jié)合后,從而將凋亡信號標(biāo)記出來。

本試劑盒應(yīng)用范圍廣，分步法適用于白光TUNEL顯色，也適用于熒光底物顯色。可以用于檢測冷凍或石蠟切片中的細(xì)胞凋亡情況，也可以檢測培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的凋亡情況。

儲存與運輸

冰袋 (wetice)     運輸 ；本試劑盒儲存在-20℃,有效期12個月。

試劑組成

試劑配制

Tunel孵育液：

操作步驟

一、樣品準(zhǔn)備

A.石蠟包埋組織切片

1.室溫下將組織石蠟切片放入二甲苯中浸泡5-10min, 重復(fù)2-3次；然后無水乙醇 浸泡5min,重復(fù)2次；最后用梯度乙醇(85% 、75% 、雙蒸水)各浸泡1次 ，每次 5min;

2.用PBS輕輕潤洗切片，并去掉樣本周圍多余液體；使用組化筆沿組織外圍輪廓畫 一個與組織間隔2-3mm 的小圈，便于下游通透性處理和平衡標(biāo)記操作；在實驗過程中，切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在 濕盒中保持樣本的濕潤；

3.配制Proteinase  K工作液：按1:99的比例，用PBS 作為稀釋液來稀Proteinase K作為工作液；

4.每個樣本上滴加50μL上述 Proteinase  K工作液，使其被全部覆蓋，37℃孵育 20min;

5.用PBS溶液浸潤清洗樣本3次，每次3min    (處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤)。

B.組織冰凍切片

1.將玻片浸沒在4%多聚甲醛溶液(溶于PBS) 中固定，室溫下孵育10-15min ;

2.片子從固定液中取出后，通風(fēng)櫥中自然晾干；

3.將玻片放入純水或PBS 中潤洗，去掉玻片上殘存的固定液；

4.用組化筆沿著組織外圍輪廓畫一個與組織間隔2-3mm 的小圈，便于下游通透性，處理和平衡標(biāo)記操作；在實驗過程中，切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤；

5.配制Proteinase  K工作液：按1:99的比例，PBS作為稀釋液來稀釋ProteinaseK作為工作液；

6.每個樣本上滴加50μL上述Proteinase  K工作液，使其被全部覆蓋，37℃孵育10min;

7.用PBS溶液浸潤清洗樣本3次，每次3min (處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤 ) 。

C.細(xì)胞爬片

1.在Lab-Tek 載玻片小室 (Chamber Slides) 上培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，在凋亡誘導(dǎo)處理之后，用PBS輕輕潤洗3遍載玻片；

2. 向每個載玻片小室中加入適量的4%多聚甲醛溶液(溶于 PBS)   固定，室溫下孵育20min;

3.去掉固定液，加入PBS 清洗3次，每次3min ;

4.每個樣本浸于破膜液中 ，室溫孵育5min 進(jìn) 行 通 透 處 理 ( 注意 ：推薦用Proteinase K工作液消化，37℃處理10min 左右，視細(xì)胞狀態(tài)調(diào)整 。若細(xì)胞易掉 片則建議選擇用破膜液處理) ;

5.在盛有PBS 溶液的敞口燒杯中浸沒清洗樣本2-3次；

6.輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

D.細(xì)胞涂片

1.以約2×107個細(xì)胞/mL  的濃度將細(xì)胞重懸于PBS 中 ，吸取50-100μL細(xì)胞懸液 滴于防脫玻片上 ，使用一片潔凈的載玻片輕柔涂開細(xì)胞懸液；

2.將玻片浸入裝有4%新鮮配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中，固定細(xì)胞 ，在4℃放置25min ;

3.將玻片浸入PBS中 ，室溫放置5min 浸洗，重復(fù)一次；

4.輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體，用組化筆沿著細(xì)胞外圍輪廓畫一個小圈 ，便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作 ，在實驗過程中， 切勿讓樣品干燥；

5.每個樣本浸于破膜液中 ，室溫孵育5 min 進(jìn)行通透處理(注意： 推薦用2-20  μ g/mL 的 Proteinase K工作液消化，37℃處理10 min 左右，視細(xì)胞狀態(tài)調(diào)整 。 若細(xì)胞易掉片則建議選擇用破膜液處理) ;

6.在盛有 PBS 溶液的敞口燒杯中浸沒清洗樣本2-3次；

7.輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體 ，處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

二 、標(biāo)記與檢測

1.標(biāo)記液配制： 按照上述比例配制Tune l孵育液；

2.標(biāo)記： 在每份組織樣本上加入50μL上述孵育液 ，在37℃孵育2-3 h ; 注意不能干片 ，載玻片要避光；

3.立即用PBS潤洗組織樣本 ，清洗3次 ，每次5 min ;

4.用濾紙輕輕擦掉樣本周圍的 PBS 溶液；

5..配制HRP標(biāo)記液：用PBST或者PBS 按1:200配制，每張切片滴加50ul左右，在37℃孵育1 h; 注意不能干片，載玻片要避光；

6.立即用PBS 潤洗組織樣本，清洗3次，每次5 min;

7.配制DAB顯色液：按照超敏DAB色原(20*)：超敏DAB底物=1:50來稀釋;

8.顯色：在每份組織樣本上加入50μL 上述顯色液,室溫孵育1-3 min,顯微鏡下控制顯色程度，樣本染色完成后，用PBS 清洗組織樣本3 次，每次5 min, 然后輕輕去掉多余液體;

9.復(fù)染核：選用蘇木素室溫復(fù)染1-2min，蘇木素分化液分化3-5s，蘇木素返藍(lán)3-5s；(推薦購買本公司P0064，P0156和P0157產(chǎn)品)

10.封片：三缸無水乙醇脫水，每缸5min，然后直接入二甲苯透明5min，中性樹膠封片。

11.鏡檢：立即在白光顯微鏡下質(zhì)檢樣本，掃描或者拍照留存圖片。

結(jié)果說明：

凋亡的細(xì)胞染色體斷裂是漸進(jìn)的。染色體DNA 首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作  用下降解成較大的片段，之后部分染色體DNA 在 Ca2+和 Mg2+ 依賴的核酸內(nèi)切酶作 用下，在核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成較小片段的核小體DNA 多聚體。因此在  細(xì)胞凋亡晚期 ，DNA 會被降解成更小的片段，斷裂的基因組DNA 上暴露出大量的3' -OH 末端，更容易被TDT酶復(fù)合物檢測。因此凋亡早期綠光信號較弱，細(xì)胞核也相對完整，凋亡信號與細(xì)胞核基本重合。細(xì)胞凋亡晚期，DNA 會被降解成較小的片段，DAPI 著色較淺或者近乎沒有，此時也暴露大量3'-OH末端，結(jié)合更多的TDT綠光信號復(fù)合物，所以到晚期可能出現(xiàn)，只有很強的綠光信號， DAPI光很弱或者沒有的結(jié)果。

正常的心、肝、肺、腎、腦等組織一般沒有明顯凋亡信號，如做了其他處理誘  導(dǎo)組織發(fā)生凋亡則會出現(xiàn)大量凋亡信。  (如心梗處、腦梗處凋亡信號會很明顯腫瘤的壞死處表達(dá)也會很強)

注意事項：

1.蛋白酶K處理時間不能過久(植物，細(xì)胞一般5min 動物組織20min),  否則會導(dǎo)致細(xì)胞核受損染不上DAPI,  處理時間太短會導(dǎo)致tunel  信號不明顯或無法標(biāo)記完整。

2.蛋白酶k處理后需要反復(fù)沖洗干凈，避免出現(xiàn)綠光片狀不均勻，影響表達(dá)的觀察。

3.試劑盒使用后及時放回常用保存溫度，避免影響效價。

4.孵育溫度保持穩(wěn)定，孵育完沖洗干凈，避免結(jié)果不均勻。

本產(chǎn)品僅供科研使用，不用于臨床診斷！

（ 產(chǎn)品包裝升級中，請以實物為準(zhǔn)）