近年來，隨著對外泌體的研究不斷深入，外泌體作為細胞間通訊的重要工具，在多種生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力。外泌體是一類由細胞分泌的納米顆粒，廣泛存在于體液中，如血液、尿液、唾液等。外泌體的獨特結(jié)構(gòu)及其所攜帶的生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、RNA、DNA等，使得其在腫瘤診斷、藥物遞送、免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要的研究價值。

為了進一步解析外泌體的結(jié)構(gòu)與功能，透射電子顯微鏡（TransmissionElectronMicroscopy,TEM）作為一種高分辨率的成像技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于外泌體研究中。電鏡染色是電鏡技術(shù)中至關(guān)重要的一步，它可以增強外泌體在電鏡下的對比度，幫助研究者清晰觀測其超微結(jié)構(gòu)。如何正確進行外泌體電鏡染色？在本文中，我們將為大家詳細介紹外泌體電鏡染色的關(guān)鍵步驟與技巧。

皮諾飛生物外泌體電鏡

1.外泌體樣品準備

外泌體電鏡染色的第一步是樣品的準備。為了獲得高質(zhì)量的電鏡圖像，外泌體樣品的分離和純化是非常重要的步驟。常用的外泌體分離方法包括超速離心法、密度梯度離心法和免疫親和捕獲法等。

超速離心法：這是目前最常用的外泌體分離方法，通過多步離心逐步去除大顆粒物質(zhì)，最終獲得富含外泌體的上清液。

密度梯度離心法：進一步提高外泌體的純度，將其與其他細胞碎片、蛋白質(zhì)等分開。采用蔗糖或碘化銫等密度梯度介質(zhì)，可以在分離過程中更好地保留外泌體的完整性。

免疫親和捕獲法：利用外泌體膜表面特異性標志物（如CD63、CD81等）進行免疫捕獲，能夠進一步提高外泌體的特異性，但對設(shè)備要求較高。

樣品分離后，應(yīng)立即進行電鏡樣品的制備和固定，以保證外泌體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

2.固定和脫水

為了確保外泌體樣品在電鏡下的形態(tài)保持不變，固定步驟至關(guān)重要。一般采用化學(xué)固定劑如戊二醛（glutaraldehyde）進行固定。

固定過程：在分離出的外泌體樣品中加入2.5%戊二醛溶液，并在室溫下孵育15-30分鐘。戊二醛能夠交聯(lián)外泌體膜蛋白，形成牢固的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而保護外泌體的原生形態(tài)。

脫水過程：固定后的外泌體樣品需要經(jīng)過梯度乙醇脫水處理，常見的乙醇梯度為30%、50%、70%、90%、100%。脫水的目的是去除樣品中的水分，防止樣品在真空環(huán)境下發(fā)生收縮或變形。

在此過程中，需注意固定劑的濃度及孵育時間的控制，過長的固定時間可能會導(dǎo)致樣品過度交聯(lián)，影響其電鏡成像質(zhì)量。

3.樣品上載與薄膜準備

外泌體樣品的固定和脫水完成后，需要將樣品轉(zhuǎn)移到電鏡載網(wǎng)（grid）上，并進行薄膜準備。電鏡載網(wǎng)通常由銅或鎳材料制成，其表面涂有一層碳或硅膜，以增強樣品的附著力。

樣品上載：將一小滴外泌體懸液滴加到電鏡載網(wǎng)上，讓其自然干燥。樣品可以通過重力作用沉積在載網(wǎng)表面。

薄膜準備：為了避免樣品在觀察過程中受到電子束的損傷，載網(wǎng)表面可以加上一層厚度為幾納米的碳膜或硅膜。這層膜既可以增強樣品的穩(wěn)定性，又不會影響電子的穿透性。

當樣品成功沉積在載網(wǎng)上后，即可進入下一步——染色。

4.電鏡染色技術(shù)

外泌體的電鏡染色主要是為了提高其在透射電鏡下的成像對比度。由于外泌體本身較小且無電子密度差異，其在電鏡下的成像往往對比度較低，因此需要通過重金屬染色提高對比度。常用的電鏡染色劑包括磷鎢酸（phosphotungsticacid,PTA）和醋酸鈾（uranylacetate）。

磷鎢酸染色：是一種常用的負染色技術(shù)，通過在外泌體周圍形成對比強烈的背景來突出外泌體的結(jié)構(gòu)細節(jié)。使用1%-2%磷鎢酸溶液進行染色，操作簡單，成像效果較好。

醋酸鈾染色：是一種較為經(jīng)典的正染色技術(shù)，能夠直接與外泌體的膜蛋白或脂質(zhì)結(jié)合，形成高電子密度區(qū)域，從而增強外泌體的對比度。

染色步驟完成后，需將樣品自然晾干，以便進行透射電鏡的成像觀察。

在經(jīng)過電鏡染色之后，外泌體樣品的處理工作接近尾聲。電鏡成像過程中的一些細節(jié)操作以及成像質(zhì)量的控制，也會對最終的研究結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。因此，接下來我們將繼續(xù)探討電鏡成像的步驟和優(yōu)化技巧，以及外泌體電鏡染色應(yīng)用中的一些常見問題和解決方案。

5.皮諾飛生物外泌體電鏡結(jié)果展示：