（1）石蠟切片

脫蠟：將切片依次浸泡于二甲苯1（15min）、二甲苯2（15min）、無(wú)水乙醇1（5min）、無(wú)水乙醇2（5min）、95%乙醇（5min）、85%乙醇（5min）、75%乙醇（5min），最后用水漂洗片子。

（2）冰凍切片

組織固定：切片稍晾干 ，用通用組織固定液室溫固定15min，取出切片水洗。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.抗原修復(fù)

抗原修復(fù)通常使用1×檸檬酸（PH6.0）作為修復(fù)液，高溫高壓修復(fù)，將切片至于高壓鍋中，加入適量的修復(fù)液，關(guān)上高壓鍋，待冒起后計(jì)時(shí)，計(jì)時(shí)2min，冷卻至室溫，修復(fù)完畢。如遇表達(dá)較弱的指標(biāo)，則可用EDTA（PH9.0）作為修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)。

如遇骨組織、腦組織等易掉片組織，則采用微波修復(fù)或者胰蛋白酶修復(fù)，修復(fù)溫度控制在80℃以下，修復(fù)液可用2×檸檬酸（PH6.0），自然冷卻。

2.內(nèi)源性酶阻斷

組化筆畫(huà)圈圈住組織，將3%過(guò)氧化氫溶液滴加在切片上，一片組織約50ul染液，于室溫孵育20min。

3.血清封閉

采用與一抗不同來(lái)源的血清（通常使用10%山羊血清）進(jìn)行封閉，37℃孵育30min。

4.一抗孵育

使用抗體稀釋液按照一定濃度稀釋一抗（參考抗體官網(wǎng)或者咨詢www.intechopen.com.cn），4℃過(guò)夜孵育或者37℃孵育2h。

5.二抗孵育（使用與一抗同來(lái)源標(biāo)記的二抗）

滴加與一抗同來(lái)源標(biāo)記的二抗，每張切片滴加50ul二抗即可，37℃孵育1h。

6.孵育TSA試劑

使用TSA buffer稀釋TYR-488,在組織上滴加稀釋好的TYR-488，37℃孵育30min，再用PBS洗滌3次，每次5min。

7.抗原修復(fù)

將玻片至于1×檸檬酸中，放入微波爐高火修復(fù)5min，冷卻至室溫。

8.血清封閉

采用與一抗不同來(lái)源的血清（通常使用10%山羊血清）進(jìn)行封閉，37℃孵育30min。

9.一抗孵育

使用抗體稀釋液按照一定濃度稀釋一抗（參考抗體官網(wǎng)），4℃過(guò)夜孵育。

10.二抗孵育（使用與一抗同來(lái)源標(biāo)記的二抗）

滴加與一抗同來(lái)源標(biāo)記的二抗，每張切片滴加50ul二抗即可，37℃孵育1h。

11.孵育TSA試劑

使用TSA buffer稀釋TYR-555（CY3），在組織上滴加稀釋好的TYR-555（CY3），37℃孵育30min，再用PBS洗滌3次，每次5min。

12.DAPI染核

將DAPI工作液滴加到組織上，每張切片100ul左右，室溫孵育-2-5 min，再用PBS洗滌3次，每次5min。將液體甩干，在組織上滴加抗熒光封片劑，蓋上蓋玻片。將做好的熒光片子至于4℃避光保存。