染色步驟

一.直接法

（1）將冷凍切片、涂片、印片或單層細(xì)胞培養(yǎng)物按要求進(jìn)行固定，石蠟切片一般會(huì)在除蠟后經(jīng)過酶消化處理，然后水化。隨后，用0.01mol/L PH7.2---7.4的PBS洗滌5分鐘，在冷風(fēng)中風(fēng)干后，將樣品放入帶有水的盒子中。

（2）添加稀釋后的熒光抗體，37℃孵育30-60分鐘或4℃過夜 (3) 用PBS 緩沖液洗滌2次，蒸餾水洗滌1次

（3）含有50%甘油的緩沖液片劑

使用熒光顯微鏡進(jìn)行檢查

（4）比對(duì)染色

①陽性控制是指將已經(jīng)確認(rèn)含有目標(biāo)抗原的組織切片與待檢標(biāo)本同等處理，預(yù)期結(jié)果為陽性。

②陰性對(duì)照是指使用已知不含目標(biāo)抗原的組織切片與待檢樣本進(jìn)行相同處理，預(yù)期結(jié)果為陰性。

③進(jìn)行空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，使用缺乏特異性抗體或PBS替代特異性抗體，結(jié)果應(yīng)呈陰性反應(yīng)。

④進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)時(shí)，將熒光抗體標(biāo)記和非標(biāo)記抗體或血清等量混合后，按照上述方法處理樣本切片，預(yù)期的結(jié)果應(yīng)為陰性（一步法）。

將待檢驗(yàn)的切片分成兩組，一組加入未標(biāo)記的特異性血清，另一組加入未標(biāo)記的同種正常血清，進(jìn)行孵育后沖洗，隨后加入標(biāo)記的特異性血清（例如熒光標(biāo)記的抗體）。因?yàn)榧尤肓宋礃?biāo)記的特異性血清后，切片上的抗原已被結(jié)合，導(dǎo)致染色效果不顯著，呈現(xiàn)陰性結(jié)果；而加入同種正常血清的切片則會(huì)顯示陽性反應(yīng)（二步法）。

進(jìn)行染色時(shí)要做好對(duì)照工作，在開始實(shí)驗(yàn)時(shí)要進(jìn)行全面的對(duì)照，每次實(shí)驗(yàn)都需要進(jìn)行陰性和陽性對(duì)照。

二.間接法

(1) 樣本處理方式與直接方法相同。

將適量稀釋后的特異性抗體滴加到樣本上，放入濕盒中，在37攝氏度下孵育30至60分鐘，或者在4攝氏度下過夜。

在濕盒中放入已適當(dāng)稀釋的間接熒光抗體，并將溫度控制在37℃，處理時(shí)間為30至60分鐘。

使用PBS溶液進(jìn)行兩次洗滌，然后用雙蒸蒸餾水洗滌一次。

使用甘油緩沖液封裝玻片，并在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

染色對(duì)照：可使用陰性對(duì)照和空白對(duì)照進(jìn)行比較。

三.補(bǔ)體法

⑴標(biāo)本處理與直接法相同。

⑵將適量稀釋的特異性抗體和相同量的補(bǔ)體混合后滴加入濕盒中，在37攝氏度下孵育30分鐘，然后用磷酸緩沖鹽水洗滌3次。

⑶將經(jīng)過適當(dāng)稀釋的抗補(bǔ)體熒光抗體滴加到培養(yǎng)皿中，放置在37攝氏度下30分鐘。用磷酸緩沖鹽水洗滌2次，再用蒸餾水洗滌1次。

⑷用甘油緩沖液封裝片劑。

⑸在對(duì)照染色時(shí)，可以用正常血清替代，即經(jīng)過56攝氏度30分鐘的滅活處理后，將滅活的補(bǔ)體與特異性抗體等量混合，然后進(jìn)行染色，結(jié)果應(yīng)當(dāng)呈陰性。

四.雙重染色熒光技術(shù)

當(dāng)需要直接檢測(cè)同一樣本中的兩種抗原時(shí)，可以使用不同的熒光染料來分別標(biāo)記抗體。

雙重染色一步法：先混合兩種不同標(biāo)記的抗體，按照直接染色的步驟進(jìn)行。

雙染色的二步法：首先孵育一個(gè)標(biāo)記抗體，無需沖洗，然后再孵育另一個(gè)標(biāo)記抗體，按照間接法的步驟進(jìn)行。

五.注意事項(xiàng)

免疫熒光法適合于冰凍切片染色，因?yàn)檫@種切片通常保存抗原的能力更好。若選擇石蠟切片，則應(yīng)優(yōu)先考慮免疫酶法等染色技術(shù)。

使用熒光標(biāo)記的商品抗體進(jìn)行染色前，應(yīng)該先確定抗體的效力，找到適合的稀釋倍數(shù)后再進(jìn)行成批染色。一般來說，當(dāng)陽性物質(zhì)呈明亮熒光而背景較暗時(shí)的稀釋倍數(shù)是最適合的。高稀釋倍數(shù)的熒光抗體可減少非特異性染色，使染色結(jié)果更具特異性，但若稀釋倍數(shù)過高則可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

熒光抗體稀釋度較低時(shí)，有利于觀察結(jié)果，但可能會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性的染色，甚至產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

除去非特異性熒光。要去除非特異性熒光有很多種方法。通常情況下，冰凍切片的非特異性熒光會(huì)更明顯，而石蠟切片的非特異性熒光相對(duì)較輕。常見的處理方法包括：

①先使用非免疫血清（如10%牛血清）處理組織切片，然后進(jìn)行熒光染色。

2. 通過小鼠相應(yīng)組織的干粉吸收熒光抗體中的非特異性成份。

③確定適當(dāng)?shù)南♂尡壤颓衅穸取?/span>

選擇具有高特異性和高效力的熒光抗體。

（清洗必須要徹底。每一步驟都需要使用蒸餾水或緩沖液進(jìn)行清洗，以清除殘留在切片中的試劑，以達(dá)到特異著色的目的。在清洗時(shí)，無論是沖洗還是振蕩清洗，都應(yīng)遵循基本原則，確保清洗徹底，或者說充分稀釋上一步驟中的試劑，使其濃度降至最低。

只要有充足的時(shí)間，建議使用靜置廷長(zhǎng)的洗滌時(shí)間，以防止脫片，這是一個(gè)較好的方法。洗滌液的PH值應(yīng)該在7.2~7.4之間，太高或太低都不利于染色過程，特別是在偏堿性的PH值條件下。

孵化時(shí)間和溫度。通常最佳的時(shí)間和溫度是37℃，持續(xù)20至30分鐘。當(dāng)然，這也與抗體的強(qiáng)度、組織抗原的含量和位置、切片的厚度等因素有關(guān)。