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產(chǎn)品描述

TUNEL(TdT mediated  dUTP Nick End Labeling) 技術(shù)可對組織或細(xì)胞中凋亡小體或單個凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色，能準(zhǔn)確反映細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征。凋亡細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活而將自身染色體DNA 切斷成產(chǎn)生大量的3-OH 末端片段，利用這一特點(diǎn)，用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Trans-ferase,TdT)  將標(biāo)有標(biāo)記物 (dUTP-488)  的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移到3-OH 末端，從而將凋亡信號標(biāo)記出來。

儲存與運(yùn)輸

 冰袋 (wetice)    運(yùn)輸；本試劑盒儲存在-20℃,有效期12個月。

試劑組成

樣品準(zhǔn)備

A.石蠟包埋組織切片

1. 室溫下將組織石蠟切片放入二甲苯中浸泡5-10min, 重復(fù)2-3次；然后無水乙醇 浸泡5min,    重復(fù)2次；最后用梯度乙醇(85%、75%、雙蒸水)各浸泡1次，每次 5min;

   
   

2. 用PBS輕輕潤洗切片，并去掉樣本周圍多余液體；使用組化筆沿組織外圍輪廓畫 一個與組織間隔2-3mm   的小圈，便于下游通透性處理和平衡標(biāo)記操作；在實(shí)驗(yàn)過程中，切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤；

3. 配制 Proteinase      K工作液：按1:99的比例，用PBS 作為稀釋液來稀釋Proteinase K作為工作液；

4. 每個樣本上滴加50μL上述 Proteinase  K工作液，使其被全部覆蓋，37℃孵育 20min;

5. 用PBS溶液浸潤清洗樣本3次，每次3min  (處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的 濕潤)。

B.組織冰凍切片

1.將玻片浸沒在4%多聚甲醛溶液(溶于PBS) 中固定，室溫下孵育10-15min; 

2.片子從固定液中取出后，通風(fēng)櫥中自然晾干；

3.將玻片放入純水或PBS 中潤洗，去掉玻片上殘存的固定液；

4.用組化筆沿著組織外圍輪廓畫一個與組織間隔2-3mm   的小圈，便于下游通透性處理和平衡標(biāo)記操作；在實(shí)驗(yàn)過程中，切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤；

5.配制Proteinase    K工作液：按1:99的比例，PBS作為稀釋液來稀釋ProteinaseK作為工作液；

6.每個樣本上滴加50μL上述Proteinase  K工作液，使其被全部覆蓋，37℃孵育10min;

7.用PBS 溶液浸潤清洗樣本3 次，每次3min (處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕 潤 ) 。

C.細(xì)胞爬片

1.在Lab-Tek 載玻片小室 (Chamber   Slides) 上培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，在凋亡誘導(dǎo)處理之后，用PBS輕輕潤洗3遍載玻片；

2.向每個載玻片小室中加入適量的4%多聚甲醛溶液(溶于 PBS)  固定，室溫下孵育20min;

3.去掉固定液，加入PBS 清洗3次，每次3min;

4.每個樣本浸于破膜液中，室溫孵育5min  進(jìn) 行 通 透 處 理 ( 注 意 ： 推 薦 用Proteinase K工作液消化，37℃處理10min 左右，視細(xì)胞狀態(tài)調(diào)整。若細(xì)胞易掉片則建議選擇用破膜液處理);

5.在盛有PBS 溶液的敞口燒杯中浸沒清洗樣本2-3次；

6.輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

D.細(xì)胞涂片

1.以約2×107個細(xì)胞/mL  的濃度將細(xì)胞重懸于PBS 中，吸取50-100μL細(xì)胞懸液滴于防脫玻片上，使用一片潔凈的載玻片輕柔涂開細(xì)胞懸液；

2.將玻片浸入裝有4%新鮮配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中，固定細(xì)胞，在4℃放置25min;

3.將玻片浸入PBS中，室溫放置5min  浸洗，重復(fù)一次；

4.輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體，用組化筆沿

著細(xì)胞外圍輪廓畫一個小圈，便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作，在實(shí)驗(yàn)過程中，切勿讓樣品干燥；

5.每個樣本浸于破膜液中，室溫孵育5 min 進(jìn)行通透處理(注意：推薦用2-20 μ g/mL 的 Proteinase K工作液消化，37℃處理10 min 左右，視細(xì)胞狀態(tài)調(diào)整。若細(xì)胞

易掉片則建議選擇用破膜液處理);

6.在盛有 PBS 溶液的敞口燒杯中浸沒清洗樣本2-3次；

7.輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體，處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

二 、標(biāo)記與檢測

1.平衡：5 x    Equilibration    Buffer稀釋到1X,   每個樣本滴加50  μL     EquilibrationBuffer 使其全部覆蓋待檢樣本區(qū)域，室溫孵育10 min(此步驟可以省略)；

2.標(biāo)記液配制：按照比例配制Tunel 孵育液；

3.標(biāo)記：盡量去掉平衡的 Equilibration Buffer,然后在每份組織樣本上加入50 μLTdT 孵育緩沖液，在37℃孵育2-3 h;   注意不能干片，載玻片要避光；

4.立即用 PBS 潤洗組織樣本，清洗3次，每次5 min;

5.用濾紙輕輕擦掉樣本周圍的 PBS 溶液；

6.核染色：在每份組織樣本上加入50 μL  DAPI,室溫孵育1-3 min;

7.封片：樣本染色完成后，用 PBS 清洗組織樣本3 次，每次5 min, 然后輕輕去掉多余液體，封片；

8.鏡檢：立即在熒光顯微鏡下分析樣本，載玻片注意避光， DAPI  能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞核著色。

試劑組

實(shí)驗(yàn)流程簡圖

結(jié)果說明：

凋亡的細(xì)胞染色體斷裂是漸進(jìn)的。染色體DNA 首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解成較大的片段，之后部分染色體DNA 在 Ca2+和 Mg2+ 依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在

核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成較小片段的核小體DNA 多聚體。因此在細(xì)胞凋亡晚期 ，DNA 會被降解成更小的片段，斷裂的基因組DNA 上暴露出大量的3'-OH 末端，更容易被TDT酶復(fù)合物檢測。因此凋亡早期綠光信號較弱，細(xì)胞核也相對完整，凋亡信號與細(xì)胞核基本重合。細(xì)胞凋亡晚期， DNA 會被降解成較小的片段，DAPI 著色較淺或者近

乎沒有，此時也暴露大量3'-OH末端，結(jié)合更多的TDT綠光信號復(fù)合物，所以到晚期可能出現(xiàn)，只有很強(qiáng)的綠光信號， DAPI光很弱或者沒有的結(jié)果。正常的心、肝、肺、腎、腦等組織一般沒有明顯凋亡信號，如做了其他處理誘導(dǎo)組織發(fā)生凋亡則會出現(xiàn)大量凋亡信。  (如心梗處、腦梗處凋亡信號會很明顯腫瘤的壞死處表達(dá)也會很強(qiáng))

注意事項(xiàng)：

1.蛋白酶K處理時間不能過久(植物，細(xì)胞一般5min 動物組織20min),  否則會導(dǎo)致細(xì)胞核受損染不上DAPI,  處理時間太短會導(dǎo)致tunel  信號不明顯或無法標(biāo)記完整。

2.蛋白酶k處理后需要反復(fù)沖洗干凈，避免出現(xiàn)綠光片狀不均勻的影響表達(dá)的觀察。

3.試劑盒使用后及時放回常用保存溫度，避免影響效價。

4.孵育溫度保持穩(wěn)定，孵育完沖洗干凈，避免結(jié)果不均勻。