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皮諾飛生物分子生物熒光定量PCR技術(shù)原理及應(yīng)用

作者：admin2024-06-07 15:35 熱度：1181

熒光定量PCR

一.熒光定量PCR技術(shù)原理以及應(yīng)用？


PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction)，是以DNA半保留復(fù)制機(jī)制為基礎(chǔ)，發(fā)展出的體外酶促合成，利用堿基互補(bǔ)配對的原則，經(jīng)過高溫變性、低溫復(fù)性、子鏈延伸的不斷循環(huán)，在體外快速、選擇性地擴(kuò)增目的基因和目的DNA的一種方法。
該技術(shù)一般用于檢測樣品中目的基因的表達(dá)量。比如：在實(shí)驗(yàn)過程中，構(gòu)建了目的基因的過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)中需要在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測目的基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄水平需要用到QPCR，蛋白水平就是WB。也可用于檢測基因組DNA中目的基因的拷貝數(shù)。


二．操作流程及圖解

（1）主要步驟概述：


從細(xì)胞/血液/組織中提取RNA,檢測RNA純度---去除基因組DNA---逆轉(zhuǎn)錄成cDNA---配置QPCR預(yù)混液---QPCR384孔板排版加樣，3個復(fù)孔---上機(jī)檢測---根據(jù)CT值分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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（2）詳細(xì)圖解步驟

A.樣本收集并裂解：


組織:取-80℃冰箱中保存的新鮮冰凍組織，重量約為100mg，加入1ml Trizol試劑，用勻漿器研磨成漿，移至無RNase的1.5ml EP管中，裂解10min。
細(xì)胞：加入1ml Trizol試劑，用槍吹打混勻，移至無RNase的1.5ml EP管中，裂解10min。


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B.樣本裂解好的樣品加氯仿分層：


加入200μl氯仿，劇烈顛倒混勻數(shù)次，室溫放置5分鐘-----------4℃，12000rpm，離心15min，可見樣品分為三層：底層為有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，中間白色為DNA和蛋白------------每毫升提取液大約可吸取500-550 μL，轉(zhuǎn)移上層水相（約500μL）于另一新1.5ml EP管中，加入500μLl異丙醇，混勻后室溫靜置10min-----------4℃，12000rpm ，離心10min，管底可見白色的RNA沉淀。


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C.加酒精沉淀：


棄上清，加入無RNase的75%乙醇1ml，渦旋混勻后，4℃，10000rpm，離心5min-------------重復(fù)上述步驟一次------------棄上清，空氣中干燥RNA沉淀5-10min，將沉淀溶于DEPC水中。


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D.濃度測定：


取溶解后的RNA 2μL用微量分光光度計測定OD260、OD280以及OD260/OD280值，計算RNA的純度和濃度。（根據(jù)OD260/OD280比值，估測RNA質(zhì)量，比值在1.8-2.0之間滿足實(shí)驗(yàn)要求）


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E.反轉(zhuǎn)錄：

（1）基因組DNA去除:

Reagent

Volume（μl）

4×gDNA wiper rMix

4

Total RNA

4μg

Nuclease-Free Water

Up to16

反應(yīng)條件：用移液器輕輕吹打混勻。42℃2min.


（2）配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:

在第一步的反應(yīng)管中直接加入5×HiScripII qRT SuperMix II

Reagent

Volume（μl）

5×HiScripII qRT SuperMix II

4

第1步的反應(yīng)液

16

反應(yīng)條件：

溫度

時間

50℃

15min

85℃

5s

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F.QPCR上機(jī)：

（1）配制反應(yīng)體系：

Component


Forward Primer (10μM)

0.4μl

Reverse Primer (10μM)

0.4μl

2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix

10μl

Template DNA/cDNA

2μl

H2ONuclease-Free Water

to20μl


（2）設(shè)置反應(yīng)程序：

項(xiàng)目

溫度

時間

循環(huán)數(shù)

預(yù)變性

95℃

30sec

1

變性

95℃

10sec

40

退火/延伸

60℃

30sec

熔解曲線采集

95℃

15sec

1

60℃

60sec

95℃

15sec

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三．教會你怎樣看懂結(jié)果？

A.擴(kuò)增曲線：在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即是基線，這條線是可以自動生成也可以手動設(shè)置的。之后反應(yīng)會進(jìn)入指數(shù)增長期，這個期間擴(kuò)增曲線具有高度重復(fù)性，在該期間，可設(shè)定一條熒光閾值線，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般會將熒光閾值的缺省設(shè)置是 3-15 個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10 倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值，這個值與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系，且該值具有重現(xiàn)性。

Ct值最大的意義就是用來計算目的基因的表達(dá)量，此時就有兩個概念容易被提及，那就是絕對定量和相對定量，絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說的拷貝數(shù)。相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數(shù)。

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B.溶解曲線：通過判斷基因的融解曲線峰形是否為單一窄峰，即可判定該基因qPCR擴(kuò)增體系是否特異。染料法熒光定量，基因的融解曲線必須為單峰，定量結(jié)果才為準(zhǔn)確。

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C.CT值：Ct值誠然可以被利用來計算這兩種定量結(jié)果，但是絕對定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的絕對標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線。絕對標(biāo)準(zhǔn)品制作困難難以獲取，實(shí)驗(yàn)室基本都是選擇相對定量的方法來計算相對基因表達(dá)量。


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四．常見問題以及解答？

1.曲線圖不會看，如何理解？可以簡單解釋下嗎？

擴(kuò)增曲線：實(shí)時熒光PCR由于每個循環(huán)要監(jiān)測熒光信號值，因此都有擬合好的擴(kuò)增曲線。

熔解曲線：總的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半的溫度稱為熔解溫度(Tm)，不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G-C含量越高，Tm值越高，成正比關(guān)系。

2.Excel表中每列標(biāo)題代表意義？哪個反應(yīng)mRNA的表達(dá)量？文章中寫結(jié)果看哪列？組間比較用哪列？單位是什么？

△CT=CT目的基因-Ct內(nèi)參基因

△△CT=△CT實(shí)驗(yàn)-△CT對照

擴(kuò)增倍數(shù)=2-△△CT，擴(kuò)增倍數(shù)即為基因的表達(dá)倍數(shù)；每個編號代表每個樣本的相關(guān)數(shù)據(jù)，可根據(jù)表達(dá)量對樣本進(jìn)行比較，沒有單位。

3.只看柱狀圖可以反應(yīng)組內(nèi)及組間變化趨勢嗎？

柱狀圖是根據(jù)樣本間計算的公式做的圖，是根據(jù)實(shí)驗(yàn)事實(shí)得出來的，可以很好的反應(yīng)變化趨勢

4.如何理解“內(nèi)參”？相對含量可以代表實(shí)際表達(dá)量嗎？

1.內(nèi)參即是內(nèi)部參照，它們在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測基因的表達(dá)水平變化時常用它來做參照物。其作用是校正上樣量、上樣過程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。借助檢測每個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣定量的結(jié)果才更為可信。一般要選擇一個在處理因素作用的條件下不會發(fā)生表達(dá)改變的基因作內(nèi)參。

2.不能說等同.只是能作為表達(dá)量的一種表現(xiàn)形式,實(shí)際上是轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量

5.內(nèi)參基因：常見的內(nèi)參有哪些？

常用的內(nèi)參基因包括GAPDH、β-actin(BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。