細胞培養(yǎng)大的危險是發(fā)生培養(yǎng)物的細菌、真菌和病青等微生物的污染，為更好地保證無菌間內細胞培養(yǎng)處于一個良性的操作環(huán)境，小逸特地整理了關于在細胞培養(yǎng)過程中如何消毒滅菌及有效避免污染，供科研小伙伴參考。

要控制污染問題的出現就要對可能引起污染的因素以及實驗室常規(guī)滅菌與消毒的措施有所認識污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常見的原因有操作間或周周空間的不潔，境養(yǎng)皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底。由于有關培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)的失誤均能導致培養(yǎng)失敗，故細胞培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)都應嚴格遵守無菌操作規(guī)范，防止發(fā)生污染。

細胞培養(yǎng)對無菌環(huán)境的要求較為嚴格。微生物污染通常是造成細胞培養(yǎng)失敗的主要原因，細胞間的殺菌主要涉及空氣的殺菌，常見消毒方法分為三類：物理滅菌法（紫外線、濕熱、干烤、過濾等），化學滅菌法（各種化學消毒劑）和抗生素。

常見消毒方法

1.物理滅菌法

1.1紫外線消毒

紫外線是一種低能量的電磁輻射，可殺死多種微失物。革蘭阻性菌尤為敏感。其次是陽性菌。再次為芽孢、真菌孢子的抵抗力較強。紫外線的直接作用是通過破環(huán)微生物的核酸及蛋白質等而使其滅活，間接作用是通過紫外線照射產生的臭氧殺死微生物。直接照射培養(yǎng)室消毒，用法簡單，效果好。

紫外燈的消毒效果同紫外燈的輻射強度和照射劑量呈正相關，輻射強度隨燈距離 增加而降低，照射劑量和照射時間呈正比。因此紫外燈同被照射物的距離和照射時間要適合。離地面2米的30W燈可照射9平方米房間，每天照射2-3小時，期間可間隔30分鐘。燈管離地面2米以外要延長照射時間，2.5 米照射效果較差。紫外燈照射工作臺的距離不應超過1.5米，照射時間30分鐘為宜。由于上述各種情況的不確定性，導致紫外線殺菌效果不是很理想，一般般需要過夜殺菌。此外紫外線對人體有傷害作用，紫外燈不僅對皮膚、眼睛傷害，且對培養(yǎng)細胞與試劑等也產生不良影響，因此不要在紫外線燈照射下進行操作。

1.2高溫濕熱滅菌

壓力蒸汽滅菌是常用的高溫濕熱滅菌方法。對生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白質變性凝固而使微生物死亡。布類、物、璃器皿、屬器皿、膠和某些培養(yǎng)液都可以用這方法滅菌。

不同壓力蒸汽所達到的溫度不同，不同消毒物品所需的有效消毒壓力和時間不同。從壓力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液體），應立即放到60-70℃烤箱內烘干，再貯存?zhèn)溆?，否則，潮濕的包裝物品表面容易為微生物污染。煮沸消毒也是常用的濕熱消毒方法，它具有條件簡單、使用方便等特點。

1.3高溫干熱消毒

干熱滅菌主要是將電熱烤箱內物品加熱到160℃以上，并保持90-120分鐘，殺死細菌和芽孢，達到滅菌目的。主要用于滅菌玻璃器皿（如體積較大的燒杯、培養(yǎng)瓶）、金屬器皿以及不能與蒸汽接觸的物品（如粉劑、油劑）。

干熱滅菌后要關掉開關并使物品逐漸冷卻后在打開，切忌立即打開，以免溫度驟變而使箱內的玻璃器皿破裂。干烤箱內物品間要有空隙，物品不要靠近加熱裝置。

燒灼也是滅菌方法之一，常利用臺面上的酒精燈的火焰對金屬器皿及玻璃器皿口緣進行燒灼消毒。

1.4過濾除菌

是將液體或氣體用微孔薄膜過濾，使大于孔徑的細菌等微生物顆粒阻留，從而達到除菌目的。在體外培養(yǎng)時，過濾除菌大多用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養(yǎng)液。目前，大多實驗室采用微孔濾膜濾器除菌。關鍵步驟是安裝濾膜及無菌過濾過程。

2.化學消毒法

常見的是75%酒精及1%的新潔而滅。

75%酒精消毒的原理是通過使細菌或真菌表面的蛋白脫水，變性凝固，殺死細菌，主要用于操作者的皮膚、操作臺表面及無菌室內的壁面處理。

1%新潔而滅的殺菌原理為：①改變細胞的滲透性，使細菌破裂；②使蛋白質變性；③抑制細菌體內某些酶，使之失去活性；④因其有良好的表面活性，可高濃度聚集于菌體表面，影響細胞的新陳代謝。新潔爾滅對化膿性細菌、腸道菌及部分病毒有一定的殺滅能力；對結核桿菌、真菌的殺滅效果不好；對細菌芽胞僅能起抑制作用。

3.抗生素消毒

抗生素主要用于消毒培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過程中預防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不嚴重時的“急救”方法。不同抗生素殺滅微生物不同，應根據需要選擇。

可用于細胞培養(yǎng)的消毒滅菌方法很多，但每種方法都有一定的適應范圍。如常用的過濾除菌系統(tǒng)、紫外照射、電子殺菌燈、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒實驗室空氣；多用新潔而滅消毒實驗室地面；常用干熱、濕熱消毒劑浸泡、紫外照射等方法消毒培養(yǎng)用器皿;采用高壓蒸汽滅菌或過濾除菌方法消毒培養(yǎng)液。

細胞培養(yǎng)過程中環(huán)境污染是如何發(fā)生

1.取放細胞時引起的污染

細胞培養(yǎng)過程中，取放細胞是基本的操作,培養(yǎng)房開關門的瞬間，環(huán)境中的微生物或多或少會進入培養(yǎng)箱中，而且內外溫差導致內門冷凝水的產生，極易吸附微生物，都是造成培養(yǎng)箱污染的風險因素。

2.滅菌不徹底造成的二次污染

細胞培養(yǎng)過程中，因其它操作問題(如培養(yǎng)基潑灑，水盤污染等)，造成培養(yǎng)房的大規(guī)模污染也時常會發(fā)生， 此時就需要對培養(yǎng)箱進行滅菌消毒，常規(guī)的消毒(如紫外照射)只能達到表面消毒的效果，特別是對真菌等頑固性污染，無法進行徹底滅菌，導致后續(xù)培養(yǎng)過程中細胞污染頻發(fā)。

如何有效避免污染

1.重視細胞房管理工作，規(guī)范操作

定期進行細胞房清潔消毒工作,規(guī)范實驗人員操作（如身著白大褂、換鞋等），創(chuàng)造潔凈培養(yǎng)環(huán)境。

2.避免頻繁查看細胞

做好實驗規(guī)劃，減少培養(yǎng)箱門開關的頻率，取放細胞時需佩戴潔凈的手套，并用少量的70%醫(yī)用酒精（過多會導致培養(yǎng)箱中殘留乙醇蒸汽）擦拭培養(yǎng)瓶/皿表面，從而降低細胞培養(yǎng)箱污染的風險。

3.定期維護和滅菌，預防污染

定期清潔維護，培養(yǎng)箱內用水滅菌后使用并定期更換，選擇培養(yǎng)箱時，可優(yōu)先考慮有自動滅菌功能的培養(yǎng)箱。細胞房一旦發(fā)生污染，及時進行消毒滅菌工作。