Co-IP實(shí)驗(yàn)原理   Co-IP（Co-Immunoprecipitation)即免疫共沉淀，以抗體和抗原之間的專(zhuān)一性互作為基礎(chǔ)，用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效技術(shù)；屬于免疫沉淀技術(shù)的一類(lèi)，常被用于鑒定特定蛋白復(fù)合物的中未知蛋白組分。

      免疫共沉淀的設(shè)計(jì)理念是，假設(shè)一種已知蛋白是某個(gè)大的蛋白復(fù)合物的組成成員，那么利用這種蛋白的特異性抗體及能與抗體結(jié)合的proteinA/G珠就可能將整個(gè)蛋白復(fù)合物從溶液中“拉”下來(lái)（即pull-down），達(dá)到富集該蛋白復(fù)合物的目的；進(jìn)而通過(guò)質(zhì)譜的方式鑒定這個(gè)蛋白復(fù)合物中的其他未知成員或通過(guò)WB驗(yàn)證已知蛋白是否與預(yù)測(cè)蛋白結(jié)合。免疫共沉淀的特點(diǎn)可以概括為兩點(diǎn)，第 一是天然狀態(tài)，第二是蛋白復(fù)合物。

      相較于其他分子間相互作用檢測(cè)方法（GST pull down等），免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)在于蛋白的結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)完成，能夠反應(yīng)天然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)相互作用，結(jié)果更加真實(shí)可靠。

Co-IP實(shí)驗(yàn)流程

1：用預(yù)冷的磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，一次吸干磷酸緩沖液；

2：加入預(yù)冷的RIPABuffer（1ml/10^7個(gè)細(xì)胞、10 cm培養(yǎng)皿或150 cm2培養(yǎng)瓶，0.5 ml/5×10^6個(gè)細(xì)胞、6cm培養(yǎng)皿、75cm2培養(yǎng)瓶）;

3：用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮離，把懸液轉(zhuǎn)移到干凈的1.5ml EP管中。并置于低速搖床，4℃緩慢晃動(dòng)15min（EP管插冰上，置水平搖床上）；

4：4℃，14000rpm離心15min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中；

5：將Protein A/G瓊脂糖珠用磷酸緩沖鹽溶液洗兩遍，用磷酸緩沖鹽溶液配制成50%的Protein A/G瓊脂糖珠工作液，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠；

6：在樣品中以每1ml中加100μl的比例，加入50%的Protein A/G瓊脂糖珠工作液。水平搖床4℃搖動(dòng)10min（EP管插冰上，置水平搖床上），該步驟的目的是去除非特異性結(jié)合的蛋白；

7：4℃，14000rpm離心15min，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，去除Protein A/G瓊脂糖珠；

8：做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線（Bradford 法），測(cè)定蛋白濃度，測(cè)前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20℃保存一個(gè)月）；

9：用磷酸緩沖液將總蛋白稀釋到1μg/μl以降低裂解液中去垢劑的濃度。如果覺(jué)得你的目的蛋白的濃度低了，可以將總蛋白濃度提高到10μg/μl（假設(shè)濃度足夠）;

10：加入一定體積的抗體到500μl總蛋白中，抗體的稀釋比例因與它有作用的蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異；

11：4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫2h；激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2h室溫孵育；

12：加入100μl Protein A瓊脂糖珠來(lái)捕捉抗原抗體復(fù)合物，4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫1h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2μl過(guò)渡抗體；

13：14000rpm瞬時(shí)離心5s，收集沉淀，并且用預(yù)冷的洗滌緩沖液（或者預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液）洗滌3遍（每次加入800μl），RIPA Buffer有時(shí)候會(huì)破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物內(nèi)部的結(jié)合，可以使用磷酸緩沖鹽溶液；

14：用60μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定（60 μl足夠上三道）；

15：以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時(shí)凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應(yīng)再次煮5min變性；

注：RIPA配制：150mM Nacl，1%乙基苯基聚乙二醇，1%脫氧膽酸鈉，25mM Tris-HCl緩沖液（PH7.6)，0.1%SDS。

Co-IP實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)置

為了確保得到的結(jié)果是天然狀態(tài)下的相互作用，而不是由于某些方面造成的人工相互作用（也就是“假陽(yáng)性”），在Co-IP的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過(guò)程中，需要設(shè)置正確的對(duì)照。

      假設(shè)Co-IP實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組為“磁珠+抗X抗體+靶蛋白X+目的蛋白Y”，則可能出現(xiàn)的“假陽(yáng)性”及對(duì)應(yīng)需要設(shè)置的實(shí)驗(yàn)對(duì)照如下表所示：

      上述為了避免出現(xiàn)“假陽(yáng)性”的對(duì)照稱為陰性對(duì)照，除此之外Co-IP實(shí)驗(yàn)還會(huì)設(shè)置一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組（Input組），Input組為直接利用抗體X（抗體Y）對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行WB檢測(cè)，驗(yàn)證細(xì)胞裂解液中存在蛋白X（抗體Y）。

      在某些Co-IP實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)人員會(huì)把IP后的上清分別進(jìn)行蛋白X和蛋白Y的WB檢測(cè)，該對(duì)照組稱為output組。

      利用內(nèi)源性Co-IP實(shí)驗(yàn)為驗(yàn)證兩個(gè)蛋白是否存在已知作用，如果結(jié)果為陽(yáng)性，則可以證明兩個(gè)蛋白之間存在相互作用；但如果結(jié)果為陰性，無(wú)法證明兩個(gè)蛋白之間不存在相互作用，也有可能是蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量低等原因?qū)е?。因此在進(jìn)行內(nèi)源性Co-IP驗(yàn)證兩個(gè)蛋白是否存在相互作用時(shí)，建議先做過(guò)表達(dá)Co-IP作為對(duì)照。

Co-IP實(shí)驗(yàn)技術(shù)應(yīng)用

免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)可以用于：

1. 測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合

2. 確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔

3. 分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物

      隨著對(duì)蛋白質(zhì)研究的不斷深入，人們將免疫沉淀方法與其他方法結(jié)合起來(lái)，在其基礎(chǔ)上衍生出許多較為復(fù)雜的技術(shù)，從而使得分析方法更為多樣化，它的應(yīng)用范圍也相當(dāng)?shù)膹V泛。免疫共沉淀是用來(lái)研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的一種技術(shù)，可以應(yīng)用于蛋白復(fù)合物的研究。它可驗(yàn)證蛋白復(fù)合物的存在，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)新的蛋白復(fù)合物；免疫共沉淀技術(shù)與免疫印跡法或質(zhì)譜等方法結(jié)合，用于確定誘餌蛋白-目的蛋白在天然狀態(tài)下的結(jié)合情況，確定特定蛋白質(zhì)的新作用搭檔。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)也可以應(yīng)用于低豐度蛋白的富集和濃縮。

      同時(shí)免疫共沉淀技術(shù)是一個(gè)相對(duì)比較經(jīng)典的探討蛋白質(zhì)間相互作用的技術(shù)，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用范圍廣泛且可信度較高。蛋白質(zhì)之間相互作用滲透于機(jī)體每一個(gè)細(xì)胞的生命活動(dòng)過(guò)程中，生物學(xué)中會(huì)出現(xiàn)很多現(xiàn)象如復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、剪切、分泌、細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)和中間代謝等都受到蛋白質(zhì)間相互作用的調(diào)控。有些蛋白質(zhì)由多個(gè)亞單位組成，蛋白質(zhì)之間的相互作用就顯得尤為普遍。又有些蛋白質(zhì)結(jié)合得十分緊密；而有些蛋白質(zhì)卻只有短暫的相互作用?？墒遣徽摮霈F(xiàn)哪些種情況，它們都控制著大量的細(xì)胞生命活動(dòng)的事件，比如細(xì)胞的增殖、分化和死亡。且通過(guò)蛋白質(zhì)之間的相互作用，能改變細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)特征，比如底物結(jié)合特性、催化活性，也可以產(chǎn)生新的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)改變蛋白質(zhì)對(duì)底物的特異性有作用，還可以使其他蛋白質(zhì)失活，其他基因表達(dá)得到調(diào)控。因此，只有讓蛋白質(zhì)之間相互作用得以順利進(jìn)行，細(xì)胞的正常生命活動(dòng)過(guò)程才會(huì)得到保障。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)之間相互作用具有如此重大的意義，所以它的檢測(cè)方法的研究也備受關(guān)注與重視。自此以后蛋白相互關(guān)系的研究會(huì)愈演愈烈，未來(lái)不僅僅可以通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)來(lái)證實(shí)，還將會(huì)有越來(lái)越多的先進(jìn)技術(shù)值得去應(yīng)用和發(fā)展。

注意事項(xiàng)

1. 細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40 或Triton X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定。不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的。

2. 使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用。

3. 使用對(duì)照抗體：

單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類(lèi)單抗

兔多克隆抗體：正常兔IgG

4. 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生。

5. 要確?？贵w的特異性，即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會(huì)引起共沉淀。

6. 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來(lái)確定。